Inhibición de las actividades proteolítica y fosfolipasa A2 del veneno de Bothrops asper por el extracto etanólico de Neurolaena lobata (L) Cass / Inhibition of proteolytic and phospholipase A2 activities of Bothrops asper venom by the ethanolic extract of Neurolaena lobata (L) Cass

Neurolaena lobata es utilizada tradicionalmente en Centroamérica para tratar la mordedura de serpiente, pero su efectividad para contrarrestar el envenenamiento producido por Bothrops asper ha sido poco estudiada. Se evaluó la capacidad del extracto etanólico de sus hojas para inhibir las actividades proteolítica, fosfolipasa A2 (PLA2; evaluada como hemólisis indirecta) y coagulante del veneno in vitro. El material vegetal fue colectado en Izabal, Guatemala, secado, se hicieron extracciones con etanol y se evaluó la presencia de actividades proteolítica, PLA2 y coagulante in-trínsecas en ensayos de concentración-actividad. Los efectos inhibitorios de la actividad proteolítica y PLA2 del veneno se evaluaron después de pre-incubar concentraciones variables del extracto con concentraciones fijas de veneno. La inhibición de la actividad coagulante del veneno no fue evaluada porque el extracto presentó actividad anticoagulante intrínseca dependiente de la concentración. El extracto inhibió completamente las actividades proteolítica (CE50 = 15.7 µg/µl) y PLA2 (CE50 = 32.5 µg/µl) del veneno. El análisis fitoquímico utilizando ensayos macro y semimicrométricos de cromatografía en capa fina, demostró la presencia de flavonoides, cumarinas, saponinas, taninos, sesquiterpenlactonas y aceites esenciales en el extracto. Su efecto sobre las proteínas del veneno se evaluó por electroforesis SDS-PAGE, mostrando cambios en el patrón electroforético atribuidos a la formación de complejos moleculares con los metabo-litos del extracto. Los resultados indican que el extracto podría inhibir los efectos tóxicos del veneno inducidos por las metaloproteinasas dependientes de zinc (SVMPs) y PLA2s, pero podría afectar las alteraciones en la coagulación, coadyuvando en la desfibrinogenación inducida por el veneno.

Neurolaena lobata has been used by traditional healers in Central America to treat snakebite, but its ability to neutralize Bothrops asper envenomations needs to be proved. This study evaluated the inhibitory potential of the ethanolic extract of the leaves of N. lobata against proteolytic, phospholipase A2 (PLA2) and coagulant activities of the venom in vitro. Leaves were collected in Izabal, Guatemala, dried, extracted with ethanol and concentration-response assays were conducted to detect intrinsic proteolytic, PLA2 (evaluated as indirect hemolysis) and coagulant activities. Assays for anti-proteolytic and anti-PLA2 activities were performed after pre-incubation of several amounts of extract with a fixed concentration of venom. Inhibition assay for the coagulant effect of the venom was not tested because pre-incubation of thrombin with the extract prolonged the clotting time of plasma in a concentration-dependent manner. Proteolytic (EC50 = 15.7 µg/µl) and PLA2 (EC50 = 32.5 µg/µl) activities of the venom resulted completely inhibited by the extract. Phytochemical profiles, determined by micrometric assays and semi microanalysis by thin layer chro-matography, showed the presence of flavonoids, coumarins, saponins, tannins, sesquiterpene lactones and essential oils in the extract. SDS-PAGE was used to assess the action of the extract on the venom proteins. Results showed changes in the electrophoretic profile, probably due to the formation of insoluble complexes with plant specialized metabolites. These findings demonstrated that the extract could be able to inhibit toxic effects triggered by zinc-dependent snake venom metalloproteinases (SVMPs) y PLA2s but might aggravate the alterations induced by the venom in coagulation.

Inhibición de los efectos coagulante, fosfolipasa A2 y proteolítico del veneno de Bothrops asper por plantas usadas tradicionalmente en Centroamérica / Inhibition of the coagulant, phospholipase A2 and proteolytic effects of Bothrops asper venom by plants traditionally used in Central America

Existen pocos estudios científicos que demuestren el valor terapéutico de las plantas usadas en la medicina tradicional centroamericana para tratar el envenenamiento ofídico. En este estudio se evaluó la capacidad de los extractos etanólicos de nueve plantas de uso etnomédico en Centroamérica (Acacia hindsii, Aristolochia maxima, Bursera simaruba, Cissampelos pareira, Eryngium foetidum, Hamelia patens, Pimenta dioica, Piper peltatum y Sansevieria hyacinthoides) para inhibir el efecto coagulante del veneno de Bothrops asper. Tres de ellas (B. simaruba, E. foetidum y P. dioica) también fueron evaluadas en cuanto a su capacidad inhibitoria de los efectos fosfolipasa A2 (PLA2) y proteolítico del veneno. Las plantas fueron colectadas en Guatemala, secadas, extraídas con etanol y los efectos inhibitorios evaluados in vitro después de preincubar concentraciones variables de extracto con concentraciones fijas de veneno. Los resultados demostraron que ninguno de los extractos logró inhibir los efectos coagulante y PLA2, pero los extractos clorofilados de P. dioica y E. foetidum inhibieron efectivamente la actividad proteolítica del veneno. El tamizaje fitoquímico, mediante ensayos macro y semimicrométricos de cromatografía en capa fina, demostró la presencia de metabolitos secundarios reportados con actividad antiproteolítica (flavonoides, antocianinas, catequinas y taninos) en la composición química de los extractos de E. foetidum y P. dioica. Su efecto sobre el veneno se evaluó mediante electroforesis SDS-PAGE, demostrándose que no está mediado por degradación proteolítica de los componentes del veneno. El aislamiento y caracterización específica de sus metabolitos secundarios en futuros estudios, permitirá determinar el mecanismo de acción inhibitoria ejercido por estos extractos.

Medicinal plants have been traditionally used in Central America to treat snakebite envenomations, however, very few scientific studies aimed to demonstrate their efficacy and safety have been performed. In this study, ethanolic extracts of nine plants used in the region by traditional healers in snakebite cases (Acacia hindsii, Aristolochia maxima, Bursera simaruba, Cissampelos pareira, Eryngium foetidum, Hamelia patens, Pimenta dioica, Piper peltatum and Sansevieria hyacinthoides) were evaluated for their ability to inhibit the coagulant effect induced by the venom of the snake Bothrops asper. Three of these extracts (B. simaruba, E. foetidum and P. dioica) were also evaluated for their inhibitory effect on the phospholipase A2 (PLA2) and proteolytic activities of the venom. Plants were collected in Guatemala, dried, extracted with ethanol, and their inhibitory effects were evaluated in vitro after pre-incubation of several amounts of each extract with a challenge concentration of venom. Results showed that none of the extracts inhibited the coagulant and PLA2 effects; however, chlorophyllated extracts of E. foetidum and P. dioica effectively inhibited the proteolytic activity of the venom. Phytochemical analysis of these extracts, conducted by macrometric assays and semimicroanalysis by thin layer chromatography, identified secondary metabolites (flavones, anthocyanins, catequines and tannins) whose anti-proteolytic activities have been widely reported. SDS-PAGE analysis demonstrated that the mechanism of inhibition is not related to proteolytic degradation of the venom proteins by the plant extracts. Further studies are needed to isolate and identify the active venom inhibitory compounds of these plants, aimed to understand their mechanism of action.